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Plateforme Ultimate Humanization®

La plateforme Ultimate Humanization® combine judicieusement différentes technologies (in vivo et in vitro) afin de générer des anticorps thérapeutiques à forte valeur ajoutée. En particulier, les anticorps développés par BIOTEM présentent une très forte affinité pour leur cible, un faible risque de toxicité par réactivité croisée (« off target regognition ») et une très faible immunogénicité.

Avantages de la plateforme Ultimate Humanization® :


  • Immunisation active de primates non humains (PNH) : Génération d’anticorps PNH de haute affinité présentant de très fortes homologies avec les anticorps humains.
  • Banque hyper-immune : Construction de banques hautement représentatives des réponses immunes de PNH (ou de donneurs humains si disponible) et présentant une large reconnaissance d’épitopes.
  • Criblage par Phage Display : Criblage haut débit basé sur des critères d’affinité, de reconnaissance particulière de l’épitope, de stabilité, etc.
  • Germinalisation d’anticorps : Germinalisation extensive et facilitée des régions FR et CDR de par l’index germinal élevé des anticorps PNH (voir encadré).
  • Optimisation de séquence : Optimisation des propriétés physico-chimique des anticorps, optimisation des codons et maturation d’affinité ou d’activité biologique dans le but d’améliorer la drugabilité et manufacturabilité.


L’Index de Germinalité (GI) définit le pourcentage d’identité des régions variables d’un anticorps avec les séquences germinales humaines de l’anticorps le plus proche. Les anticorps codés par les gènes germinaux (IgM, GI = 100%) forment le véritable soi immunologique et sont parfaitement tolérés. La maturation d’affinité des anticorps humains (IgG) induit la génération d’anticorps à plus haute affinité et spécificité ayant généralement un GI compris entre 88 et 96%.

Au cours de la génération d’anticorps recombinants (antibody engineering), des mutations sont introduites afin d’optimiser leur séquences, déclenchant ainsi une baisse du GI. Il s’agit d’un risque potentiel observé sur des anticorps recombinants possédant un faible GI (< 88 %) qui sont souvent associés à des effets secondaires graves.

Afin de réduire ces problèmes de tolérances, BIOTEM garantit un GI minimum de 92% (généralement > 95%) tout en conservant l’affinité parentale.

Espèces GI* Germinalisation
IgG Humaine 88 - 96 % Facilitée & Extensive (FR & CDR)
PNHs 80 - 90 %
Lama 74 - 82 % Moyenne & Ponctuelle
Souris 70 - 80 % Difficile & Partielle (Région FR seulement)


Immunisation &
Construction de banques

Stratégie d’immunisation

Avec plus de 30 ans d’expérience, BIOTEM offre un large panel de stratégies permettant la génération de réponses immunes dirigés contre des épitopes particuliers ou des antigènes difficiles (protéines conservées, haptènes, petites modifications, etc.). Après une analyse approfondie du cahier des charges, BIOTEM définira la meilleure stratégie à adopter.

Immunisation de PNH

L’immunisation active de PNH non-consanguins (outbred) induit des réponses immunitaires fortes et naturelles contrairement aux animaux consanguins (inbred) ou transgéniques pour lesquels les réponses immunes sont plus souvent réduites. L’équipe de BIOTEM s’appuie sur une longue expérience et un fort savoir-faire dans l’immunisation des PNH et l’isolation des cellules sécrétrices d’anticorps (lymphocytes B).

  • Valeurs ajoutées de BIOTEM
  • Forte expérience dans l’immunisation de PNH
  • Stratégies optimisées pour l’immunisation avec des cibles phylogénétiques conservées
  • Immunisations d’animaux nécessitant des zones de confinement BSL-2 et BLS-3 (Biosafety level)

Génération de banques immunes

Pour chaque projet, BIOTEM construit une ou plusieurs banques hyper-immunes fortement représentative d’obtenir des anticorps :

  • De haute affinité : 10 à 1000 fois supérieure comparée aux anticorps obtenus à partir de banques synthétiques ou naïves
  • A large reconnaissance d’épitopes : Possibilité de cibler des antigènes spécifiques.
  • Présentant une faible toxicité par réactivité croisée (« off target recognition ») : Les PNH disposent d’un système de tolérance évitant la génération d’anticorps dirigés contre des antigènes du soi. Compte tenu de la très forte homologie entre le protéome des PNH et humain (>95%), la probabilité de réactivité entre un anticorps PNH et un antigène humain est donc très faible.


Phage Display &
Caractérisation des ScFv

Phage Display Screening

L’étape de criblage par Phage Display a pour objectif d’isoler les anticorps d’intérêt par un processus d’enrichissement et de criblage haut débit appelé biopanning (cf. schéma de droite).

En fonction des projets et de la nature des réponses immunitaires, BIOTEM implémentera la stratégie de criblage la plus pertinente : direct, compétitif ou soustractif.

Les candidats scFv isolés à l’issue du criblage sont sélectionnés et séquencés avant d’être produits et caractérisés.

Ainsi les meilleurs candidats sont identifiés grâce à:

  • L’index de Germinalité
  • L’affinité de l’anticorps
  • L’activité biologique
  • Les caractéristiques biophysiques
  • Le taux d’expression




Germinalisation &
Optimisation

Germinalisation d’anticorps

Contrairement aux anticorps dérivés d’espèces phylogénétiquement éloignées (souris, rats, lamas,…), les anticorps dérivés de la plateforme Ultimate Humanization® sont extensivement germinalisés dans les régions charpentes (FR) et hypervariables (CDR). Les anticorps ainsi obtenus présentent typiquement des GI supérieurs à 95% toute en conservant l’affinité et la spécificité des anticorps parentaux.

La germinalisation extensive est notamment obtenue grâce à la germinalisation des régions CDR lesquelles sont prédites pour être très immunogéniques mais essentielles pour la reconnaissance de l’antigène.

Optimisation de séquence

Afin d’améliorer la drugabilité et d’anticiper la manufacturabilité de l’anticorps, l’offre de BIOTEM inclue une optimisation de séquence si nécessaire :

  • Optimisation des propriétés physico-chimique : Des substitutions d’acides aminés spécifiques seront propopsées afin d’éviter les modifications post-traductionnelles susceptibles d’affecter la production, la stabilité, la solubilité, l’aggrégation, l’hétérogénéité, etc.
  • Maturation de l’anticorps :En fonction du projet, une maturation d’affinité in vitro et/ou une optimisation des fonctions biologiques seront proposées.
  • Optimisation de codon : La séquence codante de l’anticorps sera optimisée pour augmenter la productivité dans le système d’expression du client.

Analyses bio-informatiques

Identification des résidus potentiels (domaines VL et VH) à muter pour :

  • La germinalisation extensive (régions FR & CDR)
  • L’optimisation de séquence

Tests in vitro

Identification des variants potentiels

  • Production de variants par mutagénèse dirigée
  • Détermination de l’affinité

Intégration des mutations validées

  • Affinité parentale préservée
  • GI garanti > 92 % (généralement ≈ 95 %)
  • Manufacturabilité optimisée


Reformattage &
Production

Selon le cahier des charges, BIOTEM propose différentes options de production en cellules eucaryotes des candidats (avant et/ou après la germinalisation de l’anticorps).

  • Format scFv ou immunoglobuline entière (différents isotypes possibles)
  • Production de lots à petite et grande échelle
  • Protocoles de purification optimisés
  • Lots “endotoxin free”

  • Contrôle Qualité
  • Un large éventail de contrôles qualité des anticorps est disponible :
  • Analyse de la pureté
  • Détermination des constantes d’affinité
  • Analyse d’endotoxines
  • Aggrégation et oligomérisation (AUC, DLS & SEC-HPLC)
  • Stabilité (DSC & Dichroisme Circulaire)
  • Autres contrôles qualité possibles sur demande