Anticorps monoclonaux Cytométrie en Flux

1. Les spécifications du projet

Pour chaque cas, notre équipe explore et définit avec le client les enjeux du projet et le cahier des charges.

• La cible d'intérêt : protéine membranaire, protéine intra-cellulaire, peptide, modifications post-traductionnelles, etc.
• Les applications : Cytométrie / FACS, tests fonctionnels, application diagnostique ou thérapeutique, etc.
• Les particularités : Matériel disponible (protéine, lignée cellulaire, etc.), spécificité, délais, etc.

En prenant en compte ces multiples paramètres BIOTEM proposera des stratégies sur-mesure afin de répondre aux problématiques du client et garantir le succès du projet.

2. Immunisation souris et rats

La technologie hybridome est indiquée pour la génération d’anticorps monoclonaux de souris ou de rat. Pour répondre aux spécifications du client, BIOTEM dispose d’un large panel de stratégies d’immunisations qui ont fait leurs preuves pour l’obtention d’anticorps de haute affinité et spécificité. Une évaluation des sérums sera effectuée par Cytométrie en flux et ELISA afin de s’assurer qu‘une réponse immunitaire appropriée est atteinte.

• Immunisation protéique : De la production de la protéine recombinante (transfection transitoire en CHO - En savoir +) à sa préparation pour les immunisations, BIOTEM peut vous accompagner sur cette étape cruciale du projet. L’utilisation de références commerciales validées sont également possibles.
• Immunisation peptidique : BIOTEM possède l’expérience et le savoir-faire permettant d'intégrer de façon optimale tous les paramètres et contraintes du design de peptides immunogènes. Stratégie pertinente pour la génération d’anticorps dirigés contre des épitopes présélectionnés, cette approche permet également de s’affranchir des étapes de préparation des immunogènes protéiques.
• Immunisation génétique : L'immunisation génétique est une approche de choix pour le développement d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines membranaires. Cette technique implique l'utilisation d'ARN messager (ARNm) ou d’ADN complémentaire (ADNc) codant pour les protéines cibles afin de stimuler la production d'anticorps spécifiques contre ces protéines. Cette approche peut favoriser la production d'anticorps de grande affinité et de spécificité élevée, ce qui est essentiel pour cibler efficacement les protéines membranaires.
• Protocole R.A.D^® (Exclusivité) : Rapid Antibody Development permet le développement rapide d’hybridomes en moins de 1 mois et offre la possibilité de travailler sur des cibles très conservées.
• Protocole S.S.I (Exclusivité) : Small Size Immunogen, protocole optimisé pour les cibles de petite taille (<30 kDa).
• Immunisation soustractive : Ces techniques sont particulièrement utiles pour générer des anticorps dirigés contre des cibles très homologues et/ou des épitopes peu immunogéniques.
• Autres - Immunisation cellulaire ou autres : Des solutions adaptées quand les immunogènes sont difficilement disponibles ou dans le cas de cibles toxiques.

3. Fusion & criblage des hybridomes

En fonction des résultats obtenus lors de la Phase I, la décision d’initier la Phase II reviendra au client (Go/ No Go). Avec son expertise, BIOTEM propose des méthodes de criblages optimisées afin d’identifier les meilleurs hybridomes (stade oligoclonal).

• Fusion / Hybridation lymphocytaire : Les lymphocytes B issus de la rate sont fusionnés à un myélome afin d’obtenir des hybridomes (immortalisation).
• Criblages : Étape cruciale du projet, les criblages permettent d’isoler les clones réactifs et spécifiques. Les méthodes utilisées sont adaptées pour chaque projet en fonction des spécifications du client (classique, compétitif, criblages multiples, etc.). Plusieurs tours de criblages sont en général réalisés avec le maintien des hybridomes tout au long du process. BIOTEM propose la réalisation des criblages par Cytométrie en flux.
• Confirmations : Les clones positifs issus du criblage sont ensuite retestés par Cytométrie en flux et par ELISA si nécessaire. A cette étape le client aura la possibilité de tester les clones positifs dans son application.
• Banque d’ampoules : Après les tests réalisés par le client, les hybridomes sélectionnés sont sécurisés.

4. Clonage des Hybridomes

Les hybridomes sélectionnés par le client sont ensuite clonés (dilution limite). Cette étape est nécessaire pour l’obtention de lignées monoclonales stables. Une banque validée de cellules (cryotubes) sera effectuée avec notamment un contrôle de la viabilité. Une vérification de la fonctionnalité par Cytométrie en flux sera réalisée avant la validation de la banque.

Le client aura la possibilité de recevoir les surnageants intermédiaires pour réaliser des tests complémentaires dans son application.

Les cryotubes peuvent être transférés au client ou mis au gardiennage dans des containers sécurisés à BIOTEM pour les futures productions (En savoir +).

5. Production & purification des anticorps

BIOTEM propose différentes solutions pour la production et la purification des anticorps issus d’hybridomes. De la production de lot pilote jusqu’aux productions à large échelles, l’équipe BIOTEM adapte les procédés à la demande. Les productions sont systématiquement proposées en conditions Low Bovine IgG et peuvent être Low Endotoxin (< 10 EU/mg ; voire < 1 EU/mg) sur demande.

• Production in vitro : Flasque, HYPERFlask®, CELLine, Bioréacteurs, etc.
• Production in vivo : Production en liquide d’ascite conformément à la réglementation en vigueur
• Purifications : Chromatographie d’affinité, précipitation, exclusion de taille, etc. En savoir +
• Evaluation finale par Cytométrie en flux